제약회사 QC 일개미의 HPLC 적응기4 -전처리편

HPLC 초자세척 및 전처리

안녕하세용 케미걸입니다~

본분을 다하러 또 왔슴다.

오늘은 눈에 보이지 않는 오염과 싸우는 전처리 방법에 대해서 공부하려구요ㅎㅎ

크로마토그램에서 가끔 보이는 미지의 peak들 그리고 앞쪽에 슬쩍 나오는 이상한 peak는

거의 전처리시 오염 때문에 나온다고 해요.

세척과정

전처리에서 제일 중요한건 세척! 세척! 세척!

HPLC가 워낙에 예민한 장비이다보니까 오염이 되면 그게 다 peak로 나와서 분석할 때 힘들어요ㅠ

정말 의약품의 불순물, 순도에 영향을 끼치는 peak인지 아니면 오염에 의한건지 모르니까

세척을 열심히 하는게 중요하죠!

흐르는 물에 초자와 뚜껑을 3회 이상 세척하고, 초자에 물을 꽉꽉 채워서 뚜껑을 끼워줍니다.

다음엔 초음파세척기(Ultrasonicator)에 초자를 놓고 5분이상 방치해줍니다.

에어건을 이용하여 완전건조를 해줍니다. 물이 안 보일때까지 인내심을 가지고 계속 건조 건조

사용하는 용매를 이용하여 2회 이상 세척합니다.

정말 아무것도 아니고 귀찮은 과정인데, 오염도를 최소화하기 위해선 이렇게해야한다는 것!

 

칭량 및 표선

칭량도 중요해요. 정량 시험이나 유연물질 시험 중에서 표준품의 주 피크와 비교하여 순도와 함량을 구하는 계산이 있으니 칭량도 최대한 비슷하게 해야 면적 볼 때 유리해요.

그리고 통칙으로 표기 된 양의 +-10%를 지켜야한다는 것을 잊지마세용~

그리구 용매를 넣어서 표선을 하게 되는데

처음부터 플라스크에 용매를 다 채운다고 생각하지 말구

50~80%정도만 채워 넣고 vortexing을 해주세요. shaking을하면 플라스크 뚜껑에 검체가 묻어서 회수가 불가능할 수도 있고 loss가 생길 수도 있으니까요. 그 이후에 표선을 해줘야합니다.

역시 제일 중요한 것은 표선인데요. 계산식에 희석 배율이 들어가거나 시스템적합성(시험이 제대로 된 건지 확인하는 항목, 이 부분이 부적합하면 그 시험은 무효처리 된다)에서 백분율을 보기도 하기때문에 표선을 정확하게 해야합니다.

매니스커스를 보는 방법은 볼록 튀어나온 곳, 오목하게 들어간 곳의 끝단이 표시된 선에 닿도록하면 표선 성공!

 

실린지필터의 필요성

실린지에 필터를 끼워서 전처리한 샘플을 lc 바이알에 넣어줍니다. 

실린지필터는 전처리시 사용한 용매의 불순물을 제거해줍니다. 칼럼의 수명을 늘려주고 순도를 높여주니까 필터를 꼭 거치는게 좋겠죠?

다만 실린지필터가 SA 입자 크기보다 작아버리면 SA 조차 여과 되어버려서 peak가 안나올 수도 있는 대참사가 벌어지기도 합니다...ㅋㅋㅋ 그리고 정말 현저하게 크면 필터가 아예 여과를 못해서 실린지랑 필터가 빠져버리면서 터져버리는 경우도 있어요!!!! 조심조심

 

LC vial에 소분할 때엔 어떻게 해야할까

여러분 4번 그림은 제가 LC vial을 그려놓은 건데요. 잘 보시면 은근한 디테일이 있어요ㅋㅋ

vial에는 naming을 할 수 있는 공간도 있고, 눈금도 있답니다.

항상 naming을 습관화 해야해요. 전처리하는 초자에도 그렇고 lc 이동상 편에서도 라벨링을 해서 헷갈리지 않도록 해야한다구 했잖아요. LC vial도 마찬가지랍니다.

BLK, ST, SA (공시험, 표준액, 검액) 이라고 네이밍을해서 어떤 바이알이 뭔지 알아야 나중에 sequence를 만들때 헷갈리지 않겠죠? 네이밍을 하지 않은 채 바이알이 섞였다고 생각해보세요... 스트레스 엄청 받아요ㅋㅋㅋ

그리고 바이알에 소분할 때 너무 적게도 많게도 소분하면 안됩니다. 1.5mL 바이알 기준으로 1.0mL ~ 1.5mL의 눈금 사이 양만큼 소분을 해야 좋다구 합니다!

그림을 보면 깨알 같이 최대 눈금을 넘지 않았어요ㅋㅋ

또 소분 시에 버블이 끼지 않도록 조심하세요! 잘못하면 바이알 주둥이 부분에 막이 생겨서 샘플이 들어가지도 않고 줄줄 새기도 하고, 마지막에 버블이 끼어있는걸 확인하지 못한다면 lc 분석 시에 용액이 아닌 버블이 들어갈 수도 있어요...

뚜껑을 끼는 것도 중요해요. 중요한게 많죠??

뚜껑을 너무 꽉 끼면 바이알 내에 압력이 차서 LC 기기 내에 있는 시린지가 통과하면서 용액이 삐져 나와버리는 상황이 벌어진대요.

소분하는 순서도 있는데요. BLK에 먼저 소분을 해야 오염을 방지 할 수 있습니다. 항상 농도가 낮은 것부터 높은것 순서대로 소분하고 있습니다ㅎㅎㅎ

 

오늘은 LC에서 제~~~~일 중요하다고 생각하는 전처리를 얘기해봤습니당

다음엔... 아마 검출기에 대해서 공부를 하고.. 마지막 순서로는 Sequence(분석 순서) 짜는 법으로

HPLC 공부를 마치도록 하겠습니다.

 

꾸준히 업데이트하겠습니다. 감사합니다