제약회사 QC 일개미의 HPLC 적응기5 :검출기편(1)

안녕하세요. Chemi_girl입니다.

오늘은 검출기편에 대해서 정리 및 공부를 하려고 합니다.

저는 UV/Vis 검출기 밖에 안 써봐서... 너무 지식이 얕은것 같아서 이 편을 쓰기가 꺼려졌는데,

한 댓글을 읽고 공부를 해서라도 검출기 편을 써야겠다고 결심했습니다.

추진력을 주신 그 분께 다시 한 번 감사 인사 드립니다!!

 

HPLC의 검출기는 정말 다양한 종류의 검출기가 있었는데요. 그 중에 아래 다섯가지 검출기를 공부해보겠습니다.

1. 자외가시광선 검출기

2. 굴절률 검출기

3. 형광 검출기

4. 전기화학적 검출기

5. 전도도 검출기

 

1. 자외가시광선 검출기 (UV-vis Detector)

특징: HPLC에서 제일 많이 사용 되는 검출기

장점	단점
비파괴성, 높은 신뢰성, 쉬운 사용법	발색 화합물이 없으면 사용 불가능
거의 모든 유기체를 분석할 수 있음	이동상이 해당 파장을 흡수하면 안됨
이동상의 비율이 바뀌어도 영향을 받지 않음	몰흡광도계수에 영향을 받음
원료의약품(API)과 그 유연물질에 대해서 선택적 검출 가능
높은 정확성과 직선성

위의 표를 보면 장점이 많아서 제일 많이 사용 되는 검출기가 된 것 같다.

비파괴성, 높은 신뢰성, 쉬운 사용법은 초보자에게 정말 큰 이점이 된다.

단점 중에 몰흡광도계수에 영향을 받는 것은 Beer-Lambert's Law를 참고하면 되는데

A=eBC (A: 흡광도, e: 몰흡광계수, B: pathlength , C: 농도)라는 식을 말한다.

농도가 낮아도 몰흡광계수가 크면 peak가 크게 보이기 때문에 실제 농도와는 다를 수 있다는 점이 단점이 되겠다.

원리

아니 이미지가 이렇게 안 좋을수가...

말로 풀어 보자면

원하는 파장에 대한 램프가 선택 되고 > 거울로 반사 되고 > 빛의 산란이 일어나서 원하는 파장 딱 하나만 빠져 나오고 > Half mirror를 통해서 반은 Reference용으로 빠져나가고 < 또 반은 flow cell을 통해 Sample을 측정한다> 이후에 Data processing을 통해서 우리가 볼 수 있는 피크로 탄생!

원리에 관한 내용은 인터넷에 정말 많아서... 말을 아끼겠다.

실제로 operation에 관심이 많으니까 유지보수 및 주의사항을 알아보자!

1. D2 lamp(Deuterium lamp, 중수소램프)의 사용기한은 1000~2000시간, 12개월이다.
   만약 민감도가 떨어지게 된다면 교체해줘야 한다. 또한 램프가 닳게 되면 baseline noise가 심해진다.
   따라서 시험자는 시험이 끝나면 램프를 꼭 꺼줘야한다. 그리고 시험 전에 최소 15분간 켜서 안정화를 시켜놓자!
2. flow cell은 닳으면 leak error가 발생할 수 있다. flow cell은 THF,톨루엔,또는 초순수로 세척한다.

 

2. 굴절률 검출기 (Refractive Index Detector, RID)

특징: 이론적으로 무엇이든 분석 가능 (당류, 고분자화합물을 분석할 때 많이 사용됨)

장점	단점
뭐든지 분석 가능	굴절률에 영향이 가는 요소들에게 아주 민감함
먼지나 공기방울에 민감하지 않음	낮은 감도
	gradient analysis 불가능

굴절률에 영향을 주는 것들: 온도, 압력, 이동상 구성요소

이론: Background와 검체의 상대적 굴절률 차이를 이용하여 분석 (절대 굴절률이 아님!)

광원 발사 > flow cell 통과 >빛의 굴절이 일어나면서 빛의 방향이 살짝 바뀜 > photodiode가 움직이면서 빛의 세기를 측정

flow cell에서 sample 부분은 검체가 지나가는 통로, reference cell은 sample이 없는 용매만 지나가는 통로

굴절률 검출기는 아무래도 영향을 주는 요인들이 중요한 것 같아서 이를 중점으로 다뤄봐야겠다.

1. 온도

주변 온도에 대해 민감하게 반응하기 때문에 굴절률 검출기 주변 온도는 항상 일정하게 유지해야한다.
예를 들어서 heating vent에서 뜨겁거나 차가운 공기가 나올수도 있고, 직사광선에 의해서 기기 주변에 따뜻해질 수 있다..!
이동상의 온도도 분석하는동안 바뀔 수 있기 때문에, pump에서 detector까지 항상 이동상의 온도도 일정해야한다.
온도와 관련된 문제들은 보통 baseline drift로 보여진다.

정상적인 baseline과 baseline drift의 차이

2. 압력

굴절률 검출기는 7 bar 이내의 압력을 유지하도록 되어있다. 펌프의 기능이 떨어진다거나 유속의 변화, 체크밸브의 이상, 펌프에 공기방울이 낄 때, 아주 가끔 펌프 피스톤이 부러졌을 때 압력이 불안정해진다.

공기방울이 꼈다면 > degasser가 잘 작동하는지 체크, pump를 purging하여 가스를 빼내야한다.

체크밸브에 이상이 있다면 > 메탄올로 몇분동안 sonication, 또는 새것으로 교체

출처: 시마즈

1번은 버블이 꼈을 때 크로마토그램 2번은 pump malfunction에 의한 cycling baseline

 

3. 이동상

이동상은 이동상편에서도 얘기 했듯이 항상 degassing procedure를 걸쳐야함

또한 등용상용매 이동상으로만 사용을 해야한다. 또 이동상을 기기 내에서 섞는 절차를 거치면 안됨!

RID가 이동상에 녹아있는 공기에 영향을 많이 받는다고한다.

steady-ready.tistory.com/97

제약회사 QC 일개미의 HPLC 적응기2

유지보수: cell은 항상 용시조제한 이동상으로 채워져야한다.(미생물이 자랄수도 있으니까 정기적으로 이동상 교체를 해)줘야함, 특히 수용성 이동상일 때!) UV/vis 검출기를 쓸 때보다 더 오랫동안 안정화를 시켜야함.

이동상을 바꿀 때 baseline drift를 확인해서 column이 안정화를 잘 거쳤는지 확인해야한다.

 

3. 형광 검출기 (Fluorescence Detector, FLD)

특징: 유도체화를 통한 분석

장점	단점
높은 감도 ( =낮은 검출한계 =저농도도 검출 가능) *UV detector의 10~1000배 높은 감도	형광물질이 아니면 검출 불가
선택성
소량 시료 분석에 용이
enantiomer 분석 가능

이론

제논광원 방출(200~900nm) > 특정 파장만 선택해서 excitation 파장 쏘임 > flow cell로 통과하면서 sample이 excited state로 전환 > emitted 되면서 형광 방출( emission wavelength) > 필터 통과> 검출

참고사항: 형광 검출기는 최적의 흡수파장과 방출파장을 알아야함. 형광 검출기는 아주 민감하기 때문에 background에서도 신경을 많이 써야함

출처: chromatographyonline.com

위 그림은 형광 검출기를 사용했을 때 background인데,

파란색은 탈이온수, 빨간색은 HPLC급 물, 초록색은 LC-MS급 물을 사용했을 때이다.

순도가 높을수록 signal이 줄어드는 것을 알 수 있다. 파란색인 deionized water는 너무... 너무 signal이 크니까 아예 쓰질 말아야겠다ㅋㅋ

물의 순도에 따라서 이렇게 Background signal이 크게 달라지므로 최대한 고순도의 시약을 써서 분석에 방해가 없게끔해야한다.

 

===================================================

역시 검출기는 공부량도 많고 정리량도 많아서 3개만 해도 이렇게 많습니다..

전기화학적 검출기와 전도도 검출기는 다음편에 이어서 해야할 것 같습니다ㅜㅜ...!

아마 일주일 뒤에나 하지 않을까요ㅋㅋㅋ

긴 글 봐주셔서 감사합니다. 다시 돌아올게용~~~

===================================================

참고한 사이트

www.chromatographyonline.com/

Chromatography Online

www.hitachi-hightech.com/

7. Principle and Feature of Various Detection Methods (1) : Hitachi High-Tech GLOBAL