제약회사 QC 일개미의 HPLC 적응기3

HPLC에서 칼럼 설치 및 칼럼 세척, 칼럼의 종류

안녕하세욥

본분을 다하려 노력중인 케미걸입니다.

오늘은 HPLC에서 칼럼에 대해서 공부해보도록 하겠습니다.

오늘도 똥그림~ 하지만 노력만큼은 금이어따..!

칼럼 설치

칼럼은 HPLC 기기에 내장된 라인에 맞게 설치를 해야합니다.

설치라고 하니까 거창해 보이네요? 칼럼 장착이 더 맞는 듯합니다.

LC의 라인 끝에는 칼럼과 라인을 연결해주는 유니온이 있습니다.

출처: Indiamart

나사처럼 생겼죵? 이 유니온에 라인과 칼럼이 잘 장착되어야 이동상이 새지 않고 정상적인 압력으로 흘러들어갑니다.

라인과 유니온을 같이 손으로 고정시키고 다른 손으로 칼럼을 돌려서 끼워주시면 잘 장착돼요!

유니온,라인,칼럼 이 세박자가 맞지 않으면 이동상이 새어버리고, 분석이 안돼요!

HPLC 기기에는 leak sensor가 있어서, 용매가 새는 걸 감지하여 소리로 알려줘요.

또한 기기에 표시되는 압력이 너무 낮으면 그 또한 용매의 누출을 의심할 수 있습니다.

 

그리고 칼럼의 라벨을 보면

칼럼 제조처, 칼럼의 규격과 함께 화살표 표시가 있는데요. 이는 흐르는 방향을 말해요.

이동상이 흐르는 방향대로 연결을 해주어야 칼럼이 상하지가 않지요.

 

칼럼의 세척

칼럼을 사게 되면 certificate(줄여서 certi., 성적서)이 같이 와요.

거기엔 해당하는 칼럼의 제조번호, 칼럼의 규격, 칼럼 세척 방법 등이 적혀져 있는데

여기에 맞는 칼럼 세척법을 준수하여 칼럼을 세척해야합니다.

보통 50% 메탄올, 45% ACN(아세토니트릴), 90% 헥세인(10%는 IPA(아이소프로필알코올)로 채움) 중에 하나로 칼럼 세척을 진행하게 됩니다.

여기서 90% 헥세인 세척액은 이동상이 무극성일 때 사용하는 칼럼을 세척할 때 사용합니다.

 

칼럼 사용 시 주의할 점

칼럼을 사용할 땐 주의할 점이 세 개정도 있는 것 같아요.

맨 처음엔 글에도 언급했듯이 칼럼 Flow를 준수하여 제대로 끼울것이구요.

두 번째는 칼럼에 공기가 들어가지 않도록 할 것, 마지막으로는 칼럼이 마르지 않도록 할 것이에요.

칼럼에 공기가 들어가면 (흔히 에어버블이 찼다. 또는 에어가 꼈다. 라고 표현하더라구요)

크로마토그램이 일정치 않고 안정화가 되지 않아서 계속 peak가 튀는 현상을 발견하게 됩니다.

이동상만 흘려주고 있는데 뭔가 detecting 된것처럼 피크가 불규칙하게 생기지요.

이럴 때 해결책은, 유속을 점점 높여 주면서 이동상을 흘려보내 에어를 빼주면 됩니다.

보통 유속이 1.0mL/min 인데, 1.3>1.5>1.8>2.0mL/min로 차근차근 올려주면 에어버블이 빠지고 안정화를 시킬 수 있습니다.

칼럼이 마르면 안에 충진제가 말라버린다고 하더라구요? 이럴때는 이동상으로 충분히 적셔줘야 하는 것 같아요.

(확실하지 않음 ㅠ) 칼럼을 보관할 때 항상 끝이 막힌 유니온을 끼워야 합니다!

 

칼럼의 규격 살펴보기, 그 예시

규격서를 보다보면 시험항목에 필요한 칼럼이 적혀져 있는데, 그 규격을 살펴보겠습니다.

"250mm*4.6mm,5um의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴화한 실리카겔이 충진된 칼럼을 사용한다."

이렇게 표현된 경우가 있습니다.

앞에 숫자들은 뭘 의미하는 것일까요? 250mm는 칼럼의 총 길이, 4.6mm는 칼럼의 내경(안지름), 5um은 충진제의 크기를 말합니다.

그리고 저.. 길고 긴 이름 액체크로마토그래프용옥타데실실릴화한 실리카겔은 C18 칼럼을 말하는 것을 기억하면 됩니다.

옥타데실실릴화한 실리카겔 =  C18 = ODS 다 똑같은 말인데 표현 방법이 다른것일 뿐이에용

칼럼의 길이, 내경, 충진제의 종류에 따라서 이동상의 구성, 분석시간, 분석방법, 주피크의 유지시간이 다 다르니까 이를 유의하셔야합니다.

USP에서는 칼럼의 규격에 따라서 코드를 나눠놓은게 있으니, USP 규격의 의약품을 생산하는 회사라면 이 코드를 참고하여 칼럼을 선택합니다.

 

 

이상으로 칼럼에 대해서 공부를 해봤습니다!

다음엔 순서가 좀 잘못된 감이 없지 않은ㅋㅋ HPLC 전처리법에 대해서 공부를 해보겠습니다.

감사합니다~